تحليل الكافيين بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء في المشروبات: طريقة Wanyi LC3500 DAD تم التحقق منها وفقًا لـ GB 5009.139-2014

الكافيين هو قلويد ميثيل زانثين طبيعي موجود في حبوب البن وأوراق الشاي والكاكاو، وهو أحد أكثر الإضافات الوظيفية استخدامًا ومركبات النكهة المميزة في المشروبات الغازية ومشروبات الطاقة ومشروبات الشاي والقهوة الجاهزة للشرب. الاستهلاك المعتدل يزيد اليقظة ويخفف التعب، ومع ذلك فإن الاستهلاك المفرط أو طويل الأمد يمكن أن يؤدي إلى خفقان القلب والأرق والإثارة العصبية، والمجموعات الحساسة مثل النساء الحوامل والأطفال والأشخاص الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية يتحملون جرعات أقل بكثير. لذلك تحدد معايير سلامة الأغذية الوطنية حدودًا صريحة للكافيين في المشروبات.

في الصين، يعتبر المعيار الوطني لسلامة الأغذية لتحديد الكافيين في المشروبات، GB 5009.139-2014، الأساس القانوني لتحديد كمية الكافيين في مصفوفات المشروبات. أصبح الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التقنية المفضلة للمصفوفات المعقدة مثل المشروبات المركبة والمشروبات المحتوية على الحليب والمشروبات الوظيفية العشبية، وذلك بفضل فصلها الممتاز ومقاومتها القوية لتداخل المصفوفة وتحديد كميتها بدقة عالية.

احتاجت شركة مصنعة للمشروبات إلى التحقق من مستويات الكافيين في خطي إنتاج مختلفين جدًا: مشروب غازي من نوع الكولا ومشروب شاي بالحليب. تحتاج المصفوفتان إلى استراتيجيات تحضير مختلفة: يجب إزالة الغاز من العينات الغازية وتنظيفها، بينما تحتاج المنتجات المحتوية على الحليب إلى ترسيب البروتين قبل الحقن. كان يجب أن يقع كلاهما بشكل مريح ضمن نطاق المعايرة، وكان يجب أن يظل نظام الكروماتوغرافيا خاليًا من تراكم المصفوفة على مدى تسلسلات حقن طويلة.

شملت الكواشف معيار مرجعي للكافيين، ميثانول بدرجة HPLC، أكسيد المغنيسيوم، محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، وماء فائق النقاء.

• المحلول المخزون (2.0 ملجم/مل): 20 ملجم من معيار الكافيين، تم وزنه بدقة 0.1 ملجم، تم إذابته في الميثانول وتم رفعه إلى 10 مل؛ تم تخزينه عند 4 درجات مئوية مع مدة صلاحية ستة أشهر.
• المحلول الوسيط (200 ميكروجرام/مل): 5.0 مل من المحلول المخزون تم تخفيفه إلى 50 مل بالماء؛ تم تخزينه عند 4 درجات مئوية مع مدة صلاحية شهر واحد.
• محاليل العمل للمعايرة: 0.5، 1.0، 2.0، 5.0 و 10.0 مل من المحلول الوسيط تم تخفيفه إلى 10 مل، مما يعطي 10.0، 20.0، 40.0، 100 و 200 ميكروجرام/مل؛ تم تحضيره طازجًا في يوم التحليل.

مشروب من نوع الكولا: إزالة الغاز من العينة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 40 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وزن 5 جرام (بدقة 0.001 جرام)، تم تخفيفه إلى 5 مل بالماء بحيث يقع تركيز الكافيين ضمن نطاق المعايرة، تم خلطه جيدًا، إضافة 0.5 جرام من أكسيد المغنيسيوم، تم خلطه مرة أخرى وتركه ليستقر. تم ترشيح السائل الطافي عبر غشاء 0.45 ميكرومتر قبل الحقن.

مشروبات القهوة والشاي المحتوية على الحليب: وزن 1 جرام (بدقة 0.001 جرام)، تم تخفيفه إلى 10 مل بمحلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، تم خلطه جيدًا وتركه لترسيب البروتينات، ثم تم ترشيح السائل الطافي عبر غشاء 0.45 ميكرومتر.

كانت أشكال الذروة متناظرة وكانت أعداد الصفوف النظرية عالية. أظهرت حقن المذيب الفارغ عدم وجود تداخل في زمن استبقاء الكافيين، مما يؤكد أن تنظيف أكسيد المغنيسيوم وترسيب البروتين بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك يزيل مكونات المصفوفة بفعالية. أعطت ست حقن متتالية زمن استبقاء ومساحة ذروة مستقرة، مما يدل على دقة ممتازة للجهاز، بينما أثبت الاسترداد الذي يزيد عن 94% في كلا المصفوفتين الحد الأدنى من فقدان العينة وإجراء تحضير قوي.

باتباع GB 5009.139-2014، قدم نظام Wanyi LC3500 HPLC مع كشف مصفوفة الصمام الثنائي سير عمل تم التحقق منه بالكامل لتحديد الكافيين في المشروبات. الخطية عبر 10.0 إلى 200.0 ميكروجرام/مل مع r > 0.9999، والتكرار أقل من 0.3% RSD والاسترداد أعلى من 94% تؤكد أن الطريقة دقيقة ودقيقة وقابلة للتكرار لكل من المنتجات الغازية والمحتوية على الحليب. تظهر حدود الكشف البالغة 0.0446 ملجم/كجم و 0.75 ملجم/كجم الضوضاء المنخفضة والحساسية العالية للنظام، مما يجعله مناسبًا لمراقبة الجودة الروتينية والتحقق من الملصقات والامتثال التنظيمي في تصنيع المشروبات والمختبرات الخارجية.

• يوفر كشف مصفوفة الصمام الثنائي عند 272 نانومتر تحديدًا كميًا انتقائيًا ومنخفض الضوضاء للكافيين في المصفوفات الملونة والعكرة.
• يحافظ الطور المتحرك البسيط من الميثانول والماء على عمود C18 على نقل الطريقة بين المختبرات بسرعة وغير مكلفة.
• التنظيف الخاص بالمصفوفة، أكسيد المغنيسيوم للمشروبات الغازية وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك للمشروبات القائمة على الحليب، يحمي العمود ويطيل عمر خدمته.
• أزمنة الاستبقاء المستقرة والقمم المتناظرة تقلل من إعادة الحقن والعمل المتكرر في مختبرات مراقبة الجودة عالية الإنتاجية.