تحديد نظير هيدروكسي الميثيونين في العلف بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء من وايال

الميثيونين هيدروكسي أنالوج (MHA) هو إضافة حمض عضوي تستخدم على نطاق واسع في صناعة الأعلاف كبديل للميثيونين. يستخدم MHA على نطاق واسع في تغذية الدواجن (الدجاج والطيور) ،الخنازير (الخنازير الصغيرة وخنازير التشطيب)، المفترسات (البقر الحليب والبقر اللحمي) ، والزراعة المائية (السمك والصراصير). كحلول للميثيونين ، يظهر تأثيرات كبيرة في خفض تكاليف العلف ،تحسين البيئة المعوية للحيوانات، وتعزيز مناعة الحيوانات.

الكروماتوجرافي السائل عالي الأداء جنبا إلى جنب مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية مناسبة جدا لتحليل العديد من عينات الأعلاف المعقدة ، بسبب كفاءتها الممتازة في الفصل ،مقاومة قوية لتداخل المصفوفة، حساسية الكشف العالية، والنتائج الكمية المستقرة والموثوقة.تم إجراء هذه التجربة وفقًا للمعيار "تحديد مكافئ هيدروكسي الميثيونين في العلف عن طريق تصوير الكروماتوجراف السائل عالي الأداء" (GB/T 19371-2025). A Wayeal LC3400 series high performance liquid chromatograph equipped with a UV detector was employed to validate the sample pretreatment procedure and the liquid chromatographic separation and detection system، مما يسمح بالاكتشاف النوعي والتحليل الكمي الدقيق لنظير هيدروكسي الميثيونين في أنواع مختلفة من عينات العلف.

الكلمات الرئيسية: الغذاء الغذائي؛ الميثيونين هيدروكسي النظير؛ الكروماتوجرافية السائلة عالية الأداء.

1أدوات ومستجيبات

1.1 قائمة تكوينات HPLC

الجدول 1 قائمة تكوينات نظام الكروماتوجرافية السائلة عالية الأداء

1.2 قائمة المفاعلات والمعايير المرجعية

الجدول 2 قائمة المفاعلات والمعايير المرجعية

1.3 ظروف تصوير الكروماتوجرافية السائلة

الجدول 3 ظروف الكروماتوجرافية السائلة عالية الأداء

1.4 المواد التجريبية والمعدات المساعدة

منظف بالموجات فوق الصوتية

خلاط الدوران

أجهزة طرد مركزي عالية السرعة؛

الميزان التحليلي

(شايكر)

2طريقة التجربة

2.1 تحضير المحلول

2.1.1 حلول المنحنى القياسية:

يزن بدقة كمية مناسبة من مستوى الميثيونين هيدروكسي المماثل المرجعي و يذوب في 10 ٪ أسيتونيتريل لإعداد سلسلة من المحلولات القياسية في تركيزات كتلة 0.5، 1.0، 2.0، 5.0، 10.0، 200، 400، و 80.0μضخ 5 مل من كل محلول قياسي في أنابيب اختبار مغلقة 15 مل بشكل منفصل. إضافة 0.1 مل من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة 50٪ بدقة، والدوامة لمدة 15 ثانية.ثم أضف 0 بدقة.2mL من محلول حمض الفوسفوريك بنسبة 50٪ ، والدوامة لمدة 15 ثانية أخرى. الطرد المركزي عند 8000r / min لمدة 5 دقائق. تمرير السوبرناتانت من خلال مرشح غشاء ميكروبوروس قبل التحليل.

2.1.2 محلولات عينات الاختبار

يزن 5 غرام من عينة العلف في حاوية، ويضاف 50 مل من 10% من محلول الأسيتونيتريل، ويتم خلطه لمدة 30 دقيقة. وضع على المزج ويهز لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي عند 8000r / min لمدة 5 دقائق،ويحتفظ بالمواد العالية للاستخدام في وقت لاحق. تحويل بدقة 5mL من المادة المرتفعة أعلاه إلى 15mL أنبوب اختبار مغلق. إضافة بدقة 0.1mL من 50% من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم والدوامة لمدة 15s. ثم إضافة بدقة 0.2mL من محلول حمض الفوسفوريك بنسبة 50 ٪ والدوامة لمدة 15 ثانية أخرىطرد المركزي عند 8000r / min لمدة 5 دقائق. مرر المادة فوق المياه عبر مرشح غشاء ميكروبوري قبل التحليل. أعد محلولين متوازين لعينة الاختبار.

2.1.3 حلول اختبار الاسترداد:

تحويل 2.5mL بدقة من محلول العينة العالي و 2.5mL من كل محلول من السلسلة القياسية إلى أنبوب اختبار مغلق 15mL. إضافة 0.1 مل من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة 50 ٪ والدوامة لمدة 15 ثانيةثم إضافة بدقة 0.2mL من 50% من محلول حمض الفوسفور والدوامة لمدة 15 ثانية أخرى. الطرد المركزي عند 8000r / min لمدة 5 دقائق.تمرير المادة فوق المياه من خلال مرشح غشاء ميكروبوروس قبل التحليل.

3نتيجة التجربة

3.1 الخطيّة والمدى

الجدول 4 جدول تركيز المنحنى القياسي

الشكل 1 المنحنى القياسي لميثيونين هيدروكسي

ملاحظة: تم أخذ كميات مناسبة من محلول الميثيونين هيدروكسي المماثلة المرجعي المعياري وتخفيفه بشكل متسلسل إلى سلسلة من التركيزات لإعداد المنحنى المعياري.النطاق الخطي كان 0.5‬‬80.0μg/mL، وكان معامل الارتباط (R) 0.99983، مما يشير إلى خطية ممتازة للمحلل.

3.2 الدقة

الشكل 2 الكروماتوجرامات المتداخلة من اختبار الدقة للمعايير المرجعية (20.0μg/mL)

الجدول 5 بيانات اختبار الدقة للمعيار المرجعي (20.0μg/mL)

ملاحظة: معيار المرجعية لميتيونين هيدروكسي أنالوج (في تركيز 20.0μتم حقن المعدات بشكل مستمر لمدة 6 مرات، وكانت إعادة تكرار (RSD) وقت الاحتفاظ 0.084%، وكانت مساحة الذروة 0.391%، مما يشير إلى دقة جيدة للمعدات.

3.3 الاسترداد

الشكل 3 الكروماتوجرامات المتداخلة لاختبار الاسترداد لنظير هيدروكسي الميثيونين في العلف

الجدول 6 بيانات اختبار الاسترداد لميثيونين هيدروكسي أنالوج في العلف

ملاحظة: تم إضافة العينة مع معيار المرجعية بتركيز 40.0μتم تحليلها وفقًا للإجراء الموضح أعلاه. وكان العائد المكتسب 88.56٪ ، مما يشير إلى دقة جيدة للطريقة.

3.4 حد الكشف (LOD)

الشكل 4 الكروماتوجرام من الميثيونين هيدروكسي النظير المعيار (2.5μغرام/مليتر)

الجدول 7 بيانات الاختبار لمعايير المرجعية لمثيل الميثيونين هيدروكسي (2.5μغرام/مليتر)

ملاحظة: استناداً إلى بيانات الاختبار من معيار الميثيونين هيدروكسي أنالوج المرجعي عند 2.5μg/mL كما هو مبين في الجدول أعلاه، تم حساب الحد النظري للكشف (LOD) على أنه 0.033μg/mL عند نسبة الإشارة إلى الضوضاء 3 (S/N = 3).

3.5 اختبار عينة تغذية

الشكل 5 كروماتوجرام عينة تغذية

ملاحظة: تم اكتشاف الميثيونين هيدروكسي أنالوج في عينة تغذية بتركيز 0.402μغرام/ميل.

4الاستنتاج

تم إجراء هذه التجربة وفقًا للمعيار "تحديد مكافئ هيدروكسي الميثيونين في العلف عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء" (GB/T 19371-2025) ،باستخدام جهاز الروماتوجراف السائل عالي الأداء من سلسلة Wayeal LC3400 مجهز بمستشعر الأشعة فوق البنفسجيةأظهرت النتائج التجريبية أن القمة المستهدفة أظهرت تناظرًا جيدًا وعددًا كبيرًا من اللوحات النظرية.5‬‬80.0μg/ mL، كان معامل الارتباط (R) أعلى من 0.9998قيم RSD لوقت الاحتفاظ ومساحة الذروة لمعيار مرجعية MHA (20.0μوبلغت نسبة استرداد MHA في عينات الأغذية 40٪.0μوبلغت نسبة الـ 88,56% مما يدل على دقة طريقة جيدة. وقد تم تحديد الحد النظري للكشف عن MHA ليكون 0.033μتم اكتشاف MHA بنجاح في عينة تغذية بتركيز 0.402μكل البيانات المذكورة أعلاه تلبي متطلبات طريقة الصيدلة لأداء الأداة.