تحديد بقايا الإريثروميسين في بقايا تخمير المضادات الحيوية باستخدام نظام Wayeal LCMS-TQ9200 للكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي

الإريثروميسين هو مضاد حيوي من مجموعة الماكروليدات يتم إنتاجه عن طريق تخمير بكتيريا Streptomyces erythreus. يمارس تأثيره المضاد للبكتيريا في المقام الأول عن طريق تثبيط تخليق البروتين البكتيري. يعتمد إنتاج الإريثروميسين في المقام الأول على تكنولوجيا التخمير الحيوي، والتي تتضمن خطوات مثل اختيار السلالات، وزراعة البذور، والتخمير على نطاق واسع في الخزانات، والاستخلاص، والتنقية. بعد التخمير، يتم استخلاص الإريثروميسين باستخدام المذيبات العضوية (مثل أسيتات البوتيل)، ثم يتم تنقيته عن طريق التبلور أو فصل راتنج التبادل الأيوني، مما يؤدي في النهاية إلى الحصول على أملاح ذات درجة سريرية (مثل إيثيل سكسينات الإريثروميسين). ومع ذلك، فإن عملية إنتاج الإريثروميسين تولد كمية كبيرة من بقايا الفطريات (بقايا التخمير)، والتي قد تحتوي على بقايا المضادات الحيوية، والبروتينات الميكروبية، والمنتجات الثانوية الأيضية. إذا لم تتم إدارتها بشكل صحيح، فقد تدخل هذه البقايا إلى السلسلة البيئية من خلال التصريف البيئي أو الاستخدام كمضافات للأعلاف، مما يؤدي إلى مخاطر متعددة: يمكن أن يعزز الإريثروميسين المتبقي انتشار جينات مقاومة المضادات الحيوية في التربة والمسطحات المائية، مما يعطل توازن المجتمع الميكروبي؛ يتضخم من خلال السلسلة الغذائية، وقد يؤدي إلى ظهور سلالات بكتيرية مقاومة في الحيوانات أو البشر، مما يقوض فعالية المضادات الحيوية؛ علاوة على ذلك، يمكن للمادة العضوية غير المستغلة الموجودة داخل البقايا أن تسبب تلوثًا بيئيًا. لذلك، فإن التنظيم الصارم لبقايا الفطريات هو إجراء حاسم للسيطرة على التلوث الناتج عن إنتاج الإريثروميسين.

أجريت هذه التجربة بالرجوع إلى المعيار "T/PIAC 00003—2021 مجموعة معيار جمعية صناعة الأدوية الصينية - طريقة تحديد الإريثروميسين في بقايا المضادات الحيوية، والمواد الأساسية للأسمدة العضوية، والمحاصيل، والوسائط البيئية"، وذلك باستخدام نظام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة LCMS-TQ9200 لتحديد محتوى الإريثروميسين في بقايا الفطريات. تشير النتائج التجريبية إلى أن اختبار ملاءمة النظام أظهر شكل قمة جيدًا وخطية جيدة، مما يلبي المتطلبات التجريبية.

1. الأجهزة والكواشف

1.1 قائمة تكوين LCMS

الجدول 1 قائمة تكوين الأجهزة

1.2 الكواشف والمعايير

الجدول 2 قائمة الكواشف والمعايير

1.3 المواد التجريبية والمعدات المساعدة

منظف بالموجات فوق الصوتية

خلاط دوامة

جهاز طرد مركزي عالي السرعة

2. طريقة التجربة

2.1 المعالجة المسبقة للعينات

زن 0.5 جرام من العينة (بدقة 0.001 جرام) في أنبوب اختبار ذي سدادة زجاجية. أضف 50 مل من الأسيتونتريل، وقم بالدوامة لمدة دقيقة واحدة لتجانس الخليط، وقم بإجراء استخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة. ثم انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بالطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. اجمع كمية مناسبة من الرائق ومررها عبر غشاء ترشيح 0.22 ميكرومتر. تخلص من 1 مل على الأقل من المرشح الأولي، ثم انقل المرشح المتبقي إلى قنينة LC كهرمانية للتحليل.

2.2 شروط التجربة

2.2.1 شروط طريقة كروماتوغرافيا السائل

عمود الكروماتوغرافيا: C18 1.7 ميكرومتر 2.1x50mm

الطور المتحرك: أ: أسيتونتريل، ب: 0.1% حمض الفورميك في الماء

معدل التدفق: 0.3 مل/دقيقة

درجة حرارة العمود: 30 درجة مئوية

حجم الحقن: 2 ميكرولتر

2.2.2 شروط طريقة مطياف الكتلة

الجدول 3 معلمات مصدر أيون قياس الطيف الكتلي

3. نتيجة التجربة

3.1 اختبار ملاءمة النظام

أظهرت نتائج اختبار ملاءمة النظام قممًا مستهدفة محددة جيدًا دون تدخل من القمم الخارجية، مما يلبي جميع المتطلبات التجريبية.

الشكل 1 مخطط كروماتوغرام لمحلول عمل قياسي من الإريثروميسين أ (0.5 نانوغرام/مل)

3.2 النطاق الخطي

تم إعداد منحنى المعايرة للإريثروميسين أ عن طريق تخفيف المحلول القياسي تسلسليًا باستخدام محاليل عمل ذات تركيز وسيط. أظهر المنحنى خطية ممتازة عبر نطاق 0.5-500 نانوغرام/مل، مع معامل ارتباط (R²) أكبر من 0.99.

الجدول 4 النطاق الخطي للإريثروميسين أ

الشكل 2 منحنى المعايرة للإريثروميسين أ

3.3 حد الكشف (LOD) وحد التحديد الكمي (LOQ)

في هذه الطريقة، تم تحديد حد الكشف (LOD) وحد التحديد الكمي (LOQ) لمحلول الإريثروميسين أ القياسي ليكون 0.2 نانوغرام/مل و 0.5 نانوغرام/مل، على التوالي. كانت نسب الإشارة إلى الضوضاء (S/N) المقابلة 110.02 و 292.20، متجاوزة بشكل كبير الحد الأدنى للمتطلبات البالغ 3 و 10، وبالتالي تلبية معايير الحساسية التجريبية.

الشكل 3. مخططات كروماتوغرام الأيونات المستخرجة لـ LOD و LOQ للإريثروميسين أ

3.4 اختبار الدقة

تم حقن محلول الإريثروميسين أ سبع مرات متتالية، مع ظهور النتائج في الشكل أدناه. كان انحراف وقت الاحتفاظ للإريثروميسين أ 0.19%، وانحراف مساحة الذروة 0.96%، وكلاهما أقل من 5%، مما يلبي المتطلبات التجريبية.

الشكل 4. مخططات كروماتوغرام الدقة لعينة الإريثروميسين أ (7 حقن)

3.5 اختبار العينة

باتباع طريقة المعالجة المسبقة المذكورة أعلاه، كانت مساحة الذروة المستهدفة في العينة الصلبة 7.4E6. تم حسابه عبر طريقة المعيار الخارجي، وتم تحديد محتوى الإريثروميسين أ في محلول العينة ليكون 400 نانوغرام/مل.

الشكل 5 مخطط كروماتوغرام لاختبار عينة الإريثروميسين أ

4. الخلاصة

تستخدم هذه الطريقة نظام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة Wayeal LCMS-TQ9200 لتحديد محتوى الإريثروميسين أ في بقايا تخمير المضادات الحيوية. تشير البيانات إلى أن الطريقة تظهر أداءً ممتازًا: تظهر جميع القمم الكروماتوغرافية شكلًا مثاليًا دون تذييل، وتلبي الحساسية المتطلبات التجريبية. يتجاوز معامل الارتباط الخطي (R²) 0.99. تقع انحرافات وقت الاحتفاظ ومساحة الذروة لجميع المركبات عبر سبعة حقن متتالية ضمن 1%، مما يشير إلى دقة عالية. لا تظهر مخططات كروماتوغرام العينة أي تدخل من القمم الخارجية، ومحتوى العينة المقاس هو 400 نانوغرام/مل. هذه الطريقة مجهزة بنظام Wayeal LC-MS/MS، وتفي بمتطلبات التحليل النوعي والكمي الروتيني لعينات الاختبار.