تحديد مخلفات المضادات الحيوية في لحوم الدجاج بواسطة Wayeal LCMS-TQ9200

الكلمات الرئيسية:(إل سي إم إس) ، (أمفينيكول) ، سلامة الأغذية، بقايا الأدوية البيطرية.

1أداة ومستجيبات

1.1 قائمة تكوين نظام LCMS

الجدول 1 قائمة تكوينات الأدوات

1.3 مواد التجربة والمعدات المساعدة

منظف بالموجات فوق الصوتية

خلاط الدوران

بخار النيتروجين في حمام الماء

طرد مركزي عالي السرعة

2أساليب التجربة

2.1 تحضير المحلول

2.1.1 محلول 2٪ من حمض الايثيل الأسيتات: خذ 4 مل من ماء الأمونيا وقم بتخفيفه إلى 200 مل من حمض الايثيل الأسيتات.

2.1.2 محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 4٪: خذ 4 غرام من كلوريد الصوديوم، وأذقه في الماء، وتخفيفه إلى 100 مل.

2.1.3 محلول n-Hexane المشبوع بنسبة 4٪ من كلوريد الصوديوم: خذ كمية مناسبة من محلول 4% من كلوريد الصوديوم، أضف مبالغ زائدة من n-hexane، خلط، واترك للفصل الطبقة،وأخذ الطبقة العليا من الهكسان.

2.1.4 محلول العمل القياسي الداخلي المختلط: خذ كمية مناسبة من محلول العمل القياسي الداخلي المختلط.يتم تخفيفها بـ 20% من الميثانول لتحقيق كلورامفينيكول- D5 عند 10 نغ / مل ومعايير داخلية أخرى (فلورافينيكول- D3، ثيامفينيكول- D3، وفلورفينيكول أمين- D3) في 50 نيغرام/ مل لكل منهما.

2.2 المعالجة المسبقة للعينة

2.2.1 استخراج العينة: يزن 2 غرام من العينة (بدقة ±0.01 غرام) ، ويضيف 100 ميكرو لتر من محلول العمل القياسي الداخلي المختلط، ويتم التشنج لمدة دقيقة واحدة، ويضيف 10 مل من محلول أسيتات الإيثيل الأموني 2٪.الدوران لمدة 10 دقائق، طرد المركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وجمع المادة المرتفعة. أضف 10 مل أخرى من محلول 2٪ من حمض الايثيل الأسيتات الأموني إلى البقية، وكرر إجراء الاستخراج.الجمع بين اثنين من السوبرناتنتس، تبخر إلى الجفاف تحت تدفق النيتروجين عند 50 درجة مئوية، وتحتفظ للاستخدام.

2.2.2 تنقية العينة: إضافة 3 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 4٪ إلى بقايا التطهير، والدوامة للذوبان، ثم إضافة 5 مل من محلول ن - هيكساني مشبع بنسبة 4٪ من كلوريد الصوديوم، والدوامة لمدة 30 ثانية.طرد مركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتخلص من الطبقة العليا من الهكسان. كرر إجراء إزالة الدهون مرة واحدة. إضافة 5mL من 2% من محلول أسيتات الإيثيل الأموني، والدوامة لمدة 10 دقيقة، الطرد المركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق،وجمع المتحكمإضافة 5 مل أخرى من محلول 2٪ من حمض الايثيل الأسيتات الأموني إلى البقايا وتكرار إجراء الاستخراج.إضافة 1 مل من محلول الميثانول بنسبة 20٪، والدوامة لمدة 30s، تصفية من خلال غشاء، وانتظار التحليل الأدائي.

2.3 ظروف التجربة

2.3.1 ظروف تصوير الكروماتوجرافية السائلة

عمود الكروماتوجرافية: C18 1.7μm 2.1x50mm

المرحلة المتحركة: A: Acetonitrile؛ B: 2 mM Ammonium Formate في الماء

معدل التدفق: 0.3mL/min

درجة حرارة العمود: 40 °C

حجم الحقن: 5μL

2.3.2 ظروف طيف الكتلة

الجدول 3 معايير مصدر الأيونات

3نتيجة التجربة

3.1 الكروماتوجرام القياسي

تم تحديد أربعة مضادات حيوية أميد ومعاييرها الداخلية في غضون 6 دقائق.وكل مركب أظهر استجابة مرضية، تلبية المتطلبات التجريبية.

الشكل 1 كروماتوجرام 4 أمفينيكول المضادات الحيوية والمعيار الداخلي (كلورامفينيكول 0.2ng/mL ، المضادات الحيوية الأخرى 1ng/mL)

3.2 النطاق الخطي

خذ كمية مناسبة من المحلول القياسي المختلط مع الكحول الأميدي وقم بتخفيفه تدريجياً إلى سلسلة من التركيزات لإعداد منحنى قياسي.تم استخدام الطريقة القياسية الداخلية للمعادلات للتحليل الكميكان النطاق الخطي 0. 2-10 نانغ/ مل للكلورامفينيكول و 1- 50 نانغ/ مل لفلورافينيكول أمين، ثيامفينيكول، وفلورافينيكول.كان الانحراف بين نتائج الكشف الخطية والتركيزات المعروفة أقل من الحد الأقصى للمعايير المسموح بها، مع قيم R2 تتراوح من 0.9958 إلى 0.9998، مما يشير إلى خطية ممتازة لجميع المكونات.

الجدول 4 النطاق الخطي للمركبات

الشكل 2 بيانات منحنى المعايرة للمركبات الأربعة

3.3 LOD و LOQ

يحدد المعيار الوطني الصيني لسلامة الأغذية GB 31658.20-2022 أنه بالنسبة لهذه الطريقة ، فإن حد الكشف (LOD) للكلورامفينيكول هو 0.1μg / kg وحد الكمية (LOQ) هو 0.2μg/kg؛ بينما بالنسبة لـ thiamphenicol و florfenicol و florfenicol amine ، فإن LOD هو 0.5μg / kg و LOQ هو 1 μg / kg.نسبة الإشارة إلى الضوضاء لجميع المركبات المستهدفة عند التركيزات المحددة من حد الكشف (LOD) والحد الكمي (LOQ) أكبر بكثير من 3 و 10، والتي تلبي متطلبات الحساسية المحددة في المعيار الوطني.

الجدول 5 حدود الكشف والكمية لكل مركب

الشكل 3 كروماتوجرامات حدود الكشف وحدود الكمية لأربعة مركبات

3.4 اختبار الدقة

خذ تركيزات منخفضة ومتوسطة وارتفاع من محلولات الخليط القياسي للأمفينيكول، وقم بإجراء ستة حقن متتالية لمقارنة الانحرافات في وقت الاحتفاظ ومنطقة الذروة.يتم عرض النتائج في الجدول أدناهوكانت انحرافات وقت الاحتفاظ لجميع مركبات الأمفينيكول أقل من 1٪، وكانت انحرافات منطقة الذروة أقل من 5٪،تلبية متطلب دقة RSD ≤ 15% المحدد في المعيار الوطني.

الجدول 6 اختبار الدقة لكل مركب

الشكل 4 كروماتوجرامات الدقة لأربعة مركبات كحولية أميدية

3.5 اختبار استرداد المصفوفة

تم تقييم دقة طريقة الكشف هذه باستخدام اختبار استرداد القمم. إضافة تركيزات معروفة من العينات القياسية إلى عينة مصفوفة فارغة بمعدلات مختلفة للمعالجة المسبقة.تحضير عينات مصفوفة بالمصفوفة في درجة عاليةتم تحليل كل مستوى تركيز من العينات المضافة بشكل مستقل ست مرات.تم حساب معدل الاسترداد عن طريق مقارنة التركيز المكتشف في المصفوفة قبل وبعد إضافة، وبالتالي تقييم دقة الطريقة. وتظهر النتائج على النحو التالي: في مصفوفة الدجاج، وتراوحت معدلات استعادة الذروة لجميع المركبات من 94.5٪ إلى 107.2٪، مع CV داخل 5٪،تشير إلى أن الدقة تلبي متطلبات الطريقة.

الجدول 6 معدلات استرداد المركبات في مصفوفة الدجاج

3.6 اختبار العينة

تم استخراج عينات ثدي الدجاج التي تم شراؤها عشوائيا من المتاجر الكبرى وتنقيتها باستخدام طريقة معالجة العينة المذكورة أعلاه. بعد اختبار العينات على الجهاز،لم يتم الكشف عن أي من المضادات الحيوية الأربعة.

الشكل 5 كروماتوجرام أربعة مركبات الكحول الأميدية في عينات ثدي الدجاج في السوبر ماركت

4الاستنتاج

تستخدم هذه الطريقة نظام طيف الكتلة للكروماتوجرافي السائل Wayeal LCMS- TQ9200 لتحديد المضادات الحيوية لأمفينيكول في الأطعمة المشتقة من الحيواناتيسمح بالحصول على المركبات في نفس الوقت في كل من أنماط الأيونات الإيجابية والسلبيةتشير البيانات إلى أن الطريقة توفر قمم كروماتوجرافية ذات شكل جيد دون وجود رذاذ ، وحساسيتها تلبي متطلبات المعايير الوطنية.معامل الارتباط الخطي هو كل أكبر من 0.99إن انحراف وقت الاحتفاظ لجميع المركبات عبر ستة حقن متتالية هو داخل 1٪ وانحراف منطقة الذروة هو داخل 5٪ ، مما يدل على دقة جيدة.معدلات الاسترداد المرتفعة في مصفوفة الدجاج تتراوح من 94.5٪ إلى 107.2٪ ، مع CV ضمن 5٪ ، مما يشير إلى أن الدقة تلبي المتطلبات المنهجية. تم تحليل عينات ثدي الدجاج التي تم شراؤها عشوائيا من المتاجر ،ولم يتم الكشف عن أي من المضادات الحيوية الأربعة لأمفينيكولهذا يدل على أن الطريقة، المجهزة بنظام الكروماتوجرافي السائل لـ Wayealتلبي متطلبات الكشف النوعي والكمي الروتيني للعينات المستهدفة.