تحديد الأفلاتوكسين B1، وهو عامل سرطان من المجموعة 1، في المحاصيل الزيتية بواسطة نظام Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

الأفلاتوكسين ب₁هو مستقلب ثانوي شديد السمية يتم إنتاجه بشكل أساسي بواسطة الرشاشيات فلافوسو الرشاشيات الطفيلية. ومن بين عائلة الأفلاتوكسين، فهو يُظهر أقوى سمية وأوسع توزيع. إنه يمارس تأثيراته السامة عن طريق تثبيط تخليق الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) داخل الخلايا والتدخل في استقلاب البروتين، مع تأثير ضار مستهدف للغاية على الكبد.بالمقارنة مع السموم الفطرية الأخرى مثل الأوكراتوكسين والباتولين، فإن الأفلاتوكسين ب₁سامة للغاية ولها قدرة مسرطنة راسخة. وقد تم تصنيفها على أنها أ مجموعة 1 مسرطنةمن قبل منظمة الصحة العالمية (WHO). يتم اكتشافه بشكل متكرر في المحاصيل الزيتية مثل الفول السوداني والذرة والمكسرات والزيوت النباتية، مما يجعله ملوثًا ذا أولوية لمراقبة سلامة الأغذية في جميع أنحاء العالم.

التلوث بالأفلاتوكسين ب₁ويحدث هذا عادةً عندما تتعرض المحاصيل الزيتية لدرجات حرارة عالية وظروف رطوبة عالية أثناء الزراعة أو الحصاد أو التخزين، مما يعزز نمو الفطريات. علاوة على ذلك، ونظرًا لخصائصه الكيميائية المستقرة، فإن الأفلاتوكسين ب₁لا يمكن تدميرها عن طريق درجات حرارة الطهي التقليدية، مما يؤدي إلى تكرار مشاكل المخلفات في المنتجات الزراعية والأغذية المصنعة.

يمكن أن يسبب تناول جرعة عالية على المدى القصير تسممًا حادًا، حيث تظهر أعراض مثل آلام شديدة في البطن والقيء واليرقان وفشل الكبد، والتي قد تكون قاتلة في الحالات الشديدة. يؤدي التعرض لجرعات منخفضة على المدى الطويل إلى تراكمها في الكبد، مما يؤدي إلى إصابة الكبد المزمنة مثل التليف الكبدي وتليف الكبد، وقد يؤدي حتى إلى الإصابة بسرطان الكبد الأولي. السكان ذوو المناعة المنخفضة، بما في ذلك الأطفال وكبار السن والأفراد الذين يعانون من أمراض الكبد الموجودة مسبقًا، هم أكثر عرضة لخطر الإصابة بالأفلاتوكسين ب.₁تسمم.

في الصين، يحدد المعيار الوطني GB 2761-2017 (المعيار الوطني لسلامة الأغذية - المستويات القصوى للسموم الفطرية في الأغذية) الحدود القصوى لبقايا الأفلاتوكسين ب.₁في مختلف أنواع الطعام. بالإضافة إلى ذلك، GB 5009.22-2016 (المعيار الوطني لسلامة الأغذية - تحديد الأفلاتوكسينات B وG في الأطعمة)يوفر الطرق التحليلية الرسمية لتقدير الأفلاتوكسين ب₁.

تصف هذه المذكرة التطبيقية إنشاء طريقة كروماتوغرافيا سائلة لتخفيف النظائر - قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS/MS) لتحديد الأفلاتوكسين ب₁باستخدام نظام Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

الكلمات الرئيسية:رباعي ثلاثي؛ الأفلاتوكسين ب₁; تخفيف النظائر اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب.

1. الصك والكواشف

1.1 تكوين الصك

الجدول 1: قائمة تكوين الصك

1.2 الكواشف والمعايير

الجدول 2: الكواشف والمعايير

1.3 مواد التجربة والمعدات المساعدة

خلاط دوامة

جهاز طرد مركزي عالي السرعة

التوازن التحليلي

جهاز طرد مركزي

مشعب استخراج الطور الصلب (SPE) (مع مضخة فراغ)

مبخر النيتروجين

شاكر

2. طريقة التجربة

2.1 إعداد الحل

2.1.1 محلول خلات الأمونيوم 5 مليمول/لتر:قم بوزن 0.39 جم من خلات الأمونيوم، وقم بإذابتها في الماء، ثم خففها إلى 1000 مل. مزيج جيد.

2.1.1 محلول الميثانول-أسيتونتريل:أضف 100 مل من الأسيتونتريل إلى 100 مل من الميثانول، ثم اخلطهما جيدًا.

2.2 المعالجة المسبقة للعينة

2.2.1 استخراج العينة

مرر دقيق القمح من خلال منخل اختبار ذو فتحة 2 مم. قم بوزن 5 جرام من العينة (بدقة تصل إلى 0.01 جرام) في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل. أضف 100μL من محلول العمل القياسي الداخلي للنظائر (100ng/mL)، مزيج من الدوامة، والسماح بالوقوف لمدة 30 دقيقة. أضف 20 مل من محلول الماء والميثانول (70+30، حجم/حجم)، ودوّم للخلط، ثم قم بالرج على شاكر مداري لمدة 20 دقيقة. الطرد المركزي عند 6000 دورة/دقيقة لمدة 10 دقائق. جمع المادة طافية لاستخدامها لاحقا.

2.2.2 تنقية العينة

دقة نقل 4 مل المادة طافية في حاوية وإضافة 23 مل 1% تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا.

بعد أن يتم تصريف السائل الأصلي في عمود الألفة المناعية تمامًا، قم بنقل محلول العينة أعلاه إلى برميل حقنة سعة 50 مل. اضبط معدل التدفق بحيث يمر محلول العينة عبر العمود بشكل مطرد بمعدل 1 – 3 مل/دقيقة. بعد أن يتم استنزاف محلول العينة بالكامل، أضف 2 × 10 مل من الماء إلى برميل المحقنة واغسل عمود الألفة المناعية بمعدل تدفق ثابت. بعد أن يتم تصريف الماء، جفف العمود باستخدام مضخة فراغ.

افصل نظام الفراغ. ضع أنبوب اختبار متدرج 10 مل تحت عمود الألفة المناعية، وأزل برميل المحقنة 50 مل، وأضف 2 × 1 مل من الميثانول لإزالة العمود بمعدل تدفق متحكم فيه قدره 1-3 مل/دقيقة. ثم جفف العمود مرة أخرى باستخدام مضخة فراغ. جمع كل شطافة في أنبوب الاختبار.تتبخر بلطف شطافة إلى الجفاف القريب تحت تيار من النيتروجين عند 50 درجة مئوية. أضف 1 مل من الطور المتحرك الأولي، ودوامة لمدة 30 ثانية لإذابة البقايا. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر، وجمع الترشيح في قارورة أخذ العينات التلقائية للحقن اللاحقة.

2.3 حالة التجربة

2.3.1 طريقة الفصل اللوني السائل

العمود: C18، 1.7μم، 2.1×50 ملم

مرحلة الطور المتحرك: أ: محلول الميثانول-أسيتونيتريل؛ المرحلة ب: محلول خلات الأمونيوم 5 ملمول/لتر

معدل التدفق: 0.3 مل/دقيقة

درجة حرارة العمود: 40°ج

حجم الحقن: 3 ميكرولتر

2.3.2 طريقة قياس الطيف الكتلي

الجدول 3: معلمات قياس الطيف الكتلي المركب

ملاحظة: تشير العلامة النجمية (*) إلى الأيون الكمي.

3. نتيجة التجربة

3.1 اللوني القياسي

تحديد الأفلاتوكسين ب₁والمعيار الداخلي للنظائر 13C17-الأفلاتوكسين ب₁تم الانتهاء منه في غضون 5 دقائق. كما هو موضح في الشكل 1، أظهرت كلا التحليلتين أشكال ذروة ممتازة واستجابات مرضية، مما يلبي متطلبات التحليل التجريبي.

الشكل 1: اللوني للأفلاتوكسين ب₁والمعيار الداخلي للنظائر 13ج17​-الأفلاتوكسين ب₁

3.2 المدى الخطي

تم نقل حجم مناسب من محلول المخزون القياسي ومحلول العمل القياسي الداخلي للنظائر المختلطة بدقة وتخفيفه باستخدام الطور المتحرك الأولي لإعداد سلسلة من حلول العمل القياسية مع الأفلاتوكسين ب₁بتركيزات 50، 20، 10، 5، 2، 1، و0.5 نانوغرام/مل. يحتوي كل محلول على المعيار الداخلي للنظائر بتركيز 2 نانوجرام/مل. تم إنشاء منحنى المعايرة باستخدام هذه المعايير. على المدى الخطي من 0.5-50 نانوجرام/مل، وبعد التصحيح باستخدام 13C 17-الأفلاتوكسين ب₁كمعيار داخلي، الانحرافات بين الأفلاتوكسين ب المقاسة والاسمي₁وكانت التركيزات ضمن الحد الأقصى للانحراف المسموح به. وكان معامل الارتباط (R) أكبر من 0.999، مما يشير إلى خطية ممتازة.

الشكل 2: المنحنى القياسي للأفلاتوكسين ب₁

3.3 التكرار

تم حقن المحاليل القياسية بثلاثة تركيزات (1، 10، 20 نانوغرام/مل) ست مرات متتالية. وتظهر النتائج في الجدول أدناه. الانحرافات المعيارية النسبية (RSDs) لأوقات الاستبقاء وكميات العينة للأفلاتوكسين ب₁في التراكيز المنخفضة والمتوسطة والعالية كانت جميعها ضمن 5%، مما يلبي متطلبات التجربة.

الجدول 4: اختبار التكرار للأفلاتوكسين ب₁بتركيزات منخفضة ومتوسطة وعالية

3.4 استعادة الارتفاع

الأفلاتوكسين ب₁تم إضافة المحلول القياسي إلى العينة لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 نانوجرام/مل. ثم تم تحليل العينة المسننة بواسطة LC-MS/MS. وكان متوسط ​​النتيجة من ستة حقن متتالية هو 5.147 نانوجرام/مل، مع تحديد مكان الإقامة بنسبة 1.954%. وكان معدل الاسترداد المحسوب 102.94%، وهو ما يلبي متطلبات التجربة.

3.5 بقايا فارغة

بعد الحقن المستمر للمحلول القياسي 20 نانوغرام/مل، تم حقن عينة فارغة لاحقًا لتقييم المرحل. كما هو مبين في الشكل 3، لم يتم الكشف عن أي ترحيل في العينة الفارغة.

الشكل 3: المخطط اللوني الفارغ للمركب

3.6 اختبار العينة

الأفلاتوكسين ب₁لم يتم اكتشافه في العينة (أ) (الشكل 4).

الشكل 4: اللوني للأفلاتوكسين ب₁في العينة أ

4. الاستنتاج

في هذه الدراسة، تم استخدام طريقة التخفيف النظائري للكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS) لتقدير الأفلاتوكسين ب.₁تم تأسيسها باستخدام نظام Wayeal LCMS-TQ9200 لقياس الطيف الكتلي السائل جنبًا إلى جنب. توضح البيانات التي تم الحصول عليها أن جميع القمم الكروماتوغرافية تظهر أشكال قمة جيدة دون مخلفات. الحساسية تلبي المتطلبات التجريبية، ومعامل الارتباط (R) أكبر من 0.999، مما يلبي معايير الخطية. تكون إمكانية التكرار عند التركيزات المنخفضة والمتوسطة والعالية ضمن 5%، ولا يتم ملاحظة أي ترحيل للنظام بعد حقن عينة عالية التركيز. تشير هذه النتائج إلى أن الطريقة، عندما تكون مجهزة بنظام Wayeal للتحليل اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي، تفي بمتطلبات التحليل النوعي والكمي الروتيني للعينات المستهدفة.