62/2000 حماية صحة الرضع والأطفال الصغار

مقدمة

السكريات قليلة التعدد في حليب الثدي البشري (HMOs) هي مجموعة من السكريات قليلة التعدد بدرجة بلمرة لا تزيد عن 3، موجودة بشكل طبيعي في حليب الثدي البشري؛ وهي ثالث أكبر مكون صلب في حليب الثدي البشري، بعد اللاكتوز والدهون. تنظم هذه السكريات الفلورا المعوية - وخاصة تعزيز استعمار البكتيريا البيفيدوبكتيريوم في أمعاء الرضع - مع الحفاظ على صحة الأمعاء، ودعم نمو المناعة والدماغ، وممارسة تأثيرات مضادة للعدوى، ولعب دور مهم في نمو الرضع. منذ إطلاق أول تركيبة رضّع مدعمة بالـ HMOs في الولايات المتحدة في عام 2015، تم بيع مجموعة واسعة من تركيبات الرضع، ومنتجات الحليب والألبان، ومكملات صحة الجهاز الهضمي، والأطعمة الوظيفية التي تحتوي على HMOs في جميع أنحاء العالم. اعتبارًا من 1 يونيو 2023، وافقت الولايات المتحدة والاتحاد الأوروبي على سبعة أنواع من HMOs للاستخدام: 2'-فوكوسيل لاكتوز، 3'-فوكوسيل لاكتوز، ديفوكوسيل لاكتوز، لاكتو-ن-نيوتتراوز، لاكتو-ن-تتراوز، 3'-سياليل لاكتوز، و 6'-سياليل لاكتوز.

من بين طرق الكشف الشائعة عن HMOs، يتطلب الكروماتوغرافيا السائلة تفاعل اشتقاق قبل الكشف، ويتضمن تحضير عينات معقد، وغالبًا ما تكون كواشف الاشتقاق سامة؛ كما أن الطبيعة الحساسة للحرارة لـ HMOs تؤدي إلى استجابة منخفضة وتكرار ضعيف في LC-MS. على النقيض من ذلك، توفر الكروماتوغرافيا الأيونية مع الكشف الأمبيرومتري للكربوهيدرات تحضيرًا بسيطًا للعينات، واستجابة عالية، وتكرارًا جيدًا، مما يمنحها مزايا واضحة لتحليل HMOs. تستخدم مذكرة التطبيق هذه هيدروكسيد الصوديوم، وأسيتات الصوديوم، والماء فائق النقاء المحضرة يدويًا كمذيبات، وتستخدم جهاز الكروماتوغرافيا الأيونية WAYEAL IC6300 لتحديد HMOs في تركيبة الرضع. تتميز الطريقة بتحضير بسيط للعينات، وحساسية عالية، وخطية جيدة، مما يوفر مرجعًا مفيدًا للكشف عن HMOs في الأطعمة.

الكلمات المفتاحية: كروماتوغرافيا أيونية؛ سكريات قليلة التعدد في حليب الثدي البشري؛ كاشف أمبيرومتري.

1. الأجهزة والمعدات والكواشف

1.1 الكواشف والمعايير

الجدول 1. قائمة الكواشف والمعايير

1.2 مواد المختبر والمعدات المساعدة

• 1.2.1 ميزان تحليلي (دقة 0.1 ملجم)؛
• 1.2.2 حمام مائي ثابت الحرارة؛
• 1.2.3 جهاز طرد مركزي؛
• 1.2.4 مرشحات غشائية من بولي إيثر سلفون (PES) مائية (0.45 ميكرومتر)؛
• 1.2.5 ماء فائق النقاء؛
• 1.2.6 جهاز ترشيح بالشفط؛
• 1.2.7 خراطيش معالجة مسبقة بالاستخلاص بالطور الصلب (SPE) من الطور العكسي (RP)؛
• 1.2.8 محاقن للاستخدام مرة واحدة (20 مل، 5 مل).

2. الطريقة التجريبية

2.1 تحضير المحاليل

• 2.1.1 محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 200 مليمول/لتر: قم بقياس 10.5 مل من محلول NaOH بنسبة 50%، وخففه بالماء إلى 1000 مل، وقم بالترشيح تحت التفريغ.
• 2.1.2 محلول مختلط من NaOH بتركيز 75 مليمول/لتر وأسيتات الصوديوم بتركيز 250 مليمول/لتر: قم بوزن 20.51 جرامًا من أسيتات الصوديوم بدقة، وقم بإذابتها في الماء وانقلها إلى دورق حجمي سعة 1000 مل؛ قم بقياس 3.95 مل من محلول NaOH بنسبة 50% بدقة، وخففه إلى 1000 مل بالماء فائق النقاء، وقم بالترشيح تحت التفريغ.
• 2.1.3 محلول حمض السلفوساليسيليك بنسبة 3%: قم بوزن 3.0 جرامًا من حمض السلفوساليسيليك، وقم بإذابتها في الماء وخففها إلى 100 مل (قم بالتحضير طازجًا).
• 2.1.4 محلول مخزون قياسي مختلط: قم بوزن 5 ملجم من كل من 2'-فوكوسيل لاكتوز، 3'-فوكوسيل لاكتوز، 3'-سياليل لاكتوز، 6'-سياليل لاكتوز، لاكتو-ن-تتراوز، ولاكتو-ن-نيوتتراوز بدقة (لأقرب 0.1 ملجم)، وضعها في دورق حجمي سعة 10 مل، وقم بإذابتها في الماء وخففها إلى العلامة لتحضير مخزون مختلط بتركيز 500 ملجم/لتر. قم بوزن 1 ملجم من ديفوكوسيل لاكتوز بشكل منفصل (لأقرب 0.1 ملجم)، وضعها في دورق حجمي سعة 10 مل، وقم بإذابتها وخففها إلى العلامة لتحضير مخزون بتركيز 100 ملجم/لتر.
• 2.1.5 محاليل عمل قياسية مختلطة: قم بقياس المحلول المخزون المختلط (2.1.4) بدقة في دورق حجمي وخففه بالماء لتحضير محاليل عمل مختلطة من 2'-FL، 3'-FL، 3'-SL، 6'-SL، LNT، LNnT، و DFL بتركيزات 0.5، 2، 4، 6، 8، و 10 ملجم/لتر. قم بالتحضير طازجًا قبل الاستخدام.

2.2 تحضير العينة

قم بوزن حوالي 2.0 جرام من العينة في كأس صغير، واخلطها جيدًا مع 50 مل من الماء الدافئ (حوالي 50 درجة مئوية)، وأضف 40 مل من محلول حمض السلفوساليسيليك بنسبة 3%، وانقلها وخففها إلى 100 مل في دورق حجمي، وقم بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. قم بالترشيح عبر ورق ترشيح أو قم بالطرد المركزي (12000 دورة في الدقيقة، 15 دقيقة). قم بتمرير محلول العينة عبر خرطوشة SPE من الطور العكسي ثم عبر مرشح غشائي مائي بقطر 0.45 ميكرومتر؛ قم بتجاهل أول 3 مل واجمع الرشاحة للتحليل. قبل الاستخدام، قم بتكييف خرطوشة SPE من الطور العكسي مع 20 مل من الميثانول متبوعًا بـ 15 مل من الماء، وقم بالتوازن لمدة 30 دقيقة.

2.3 الظروف التجريبية

2.3.1 ظروف الكروماتوغرافيا الأيونية

3. النتائج

3.1 النطاق الخطي

تم تحليل كمية مناسبة من كل محلول عمل قياسي مختلط. كان النطاق الخطي 0.5-10 ملجم/لتر؛ وكانت الانحرافات بين التركيزات المقاسة والاسمية ضمن أقصى انحراف مسموح به، وكانت قيم R² أعلى من 0.999، وأظهرت جميع المكونات خطية جيدة.

الجدول 2. النطاقات الخطية للمركبات

الشكل 1. رسوم بيانية معايرة متراكبة للمعايير السبعة لـ HMO

3.2 نتائج اختبار العينة

تم اختبار العينتين 1 و 2 بعد تخفيف 10 أضعاف. تم حساب محتوى كل من HMOs السبعة على النحو التالي: X هو المحتوى في العينة (ملجم/100 جرام)؛ c هو التركيز في محلول العينة من منحنى المعايرة (ملجم/لتر)؛ V هو الحجم الثابت (مل)؛ m هي كتلة العينة (جرام)؛ f هو عامل التخفيف. المحتويات المحسوبة (ملجم/100 جرام) هي كما يلي:

الشكل 2. رسم بياني أيوني للعينة 1 مخففة 10 مرات

الشكل 3. رسم بياني أيوني للعينة 2 مخففة 10 مرات

الجدول 3. نتائج اختبار العينة

3.3 الدقة

تم تحليل محلول العمل عند مستوى المعايرة الرابع في ست حقنات متتالية تحت الظروف الموضحة في 2.3.1. تم حساب الانحراف المعياري النسبي (RSD) لمحتويات HMOs السبعة لتقييم التكرار. تشير النتائج أدناه إلى دقة جيدة للطريقة.

3.3.1 دقة تكرار المعيار

نتائج الاختبار:

الشكل 4. رسوم بيانية متراكبة لحقنات متكررة مستقلة للمعيار S4

الجدول 4. دقة تكرار المعيار

3.4 حدود الكشف والتقدير الكمي

حد الكشف (LOD): تم تخفيف كميات من المحلول القياسي إلى محلول مختلط يحتوي على 10 ميكروجرام/لتر من 3'-FL، و 30 ميكروجرام/لتر من DFL، و 30 ميكروجرام/لتر من 2'-FL، و 22 ميكروجرام/لتر من LNnT، و 67 ميكروجرام/لتر من LNT، و 67 ميكروجرام/لتر من 6'-SL، و 160 ميكروجرام/لتر من 3'-SL؛ تم تحضير وتحليل 20 عينة متوازية.

حد التقدير الكمي (LOQ): تم تخفيف كميات من المحلول القياسي إلى محلول مختلط يحتوي على 30 ميكروجرام/لتر من 3'-FL، و 80 ميكروجرام/لتر من DFL، و 90 ميكروجرام/لتر من 2'-FL، و 65 ميكروجرام/لتر من LNnT، و 200 ميكروجرام/لتر من LNT، و 200 ميكروجرام/لتر من 6'-SL، و 500 ميكروجرام/لتر من 3'-SL؛ تم تحضير وتحليل ست عينات متوازية.

نتائج الاختبار هي كما يلي:

الجدول 5. نتائج S/N لحدود الكشف والتقدير الكمي لـ HMOs السبعة

3.5 الخصوصية

تمت إضافة كميات (100 ميكرولتر لكل منها) من محاليل قياسية للجلوكوز، والفركتوز، والسكروز، والمالتوز إلى دورق حجمي سعة 10 مل وتخفيفها إلى العلامة بمحلول العينة 2 المخفف 67 مرة. تم تحليل المحلول للتحقق مما إذا كانت هذه السكريات تتداخل مع قمم HMOs السبعة. كما هو موضح أدناه، لم تظهر السكريات الأربعة أي تداخل كبير مع تحديد HMOs السبعة في مسحوق الحليب.

الشكل 5. رسوم بيانية متراكبة للمعيار S6، العينة 2، والعينة 2 المضافة إليها معايير السكريات الأربعة

4. الخلاصة

استخدم هذا التحقق من صحة الطريقة جهاز الكروماتوغرافيا الأيونية WAYEAL للتحقق من طريقة تحديد HMOs في الأطعمة. تظهر البيانات أن جميع قمم الكروماتوغرافيا ذات شكل جيد بدون ذيل؛ وتخرج 2'-FL، 3'-FL، DFL، LNnT، LNT، 6'-SL، و 3'-SL جميعها في غضون 60 دقيقة؛ وتلبي الحساسية متطلبات المعايير الوطنية؛ ومعاملات الارتباط الخطي جميعها أكبر من 0.999. تكرار المعايير والعينات جيد. باستثناء السياليل لاكتوزات، فإن حدود الكشف والتقدير الكمي عند مستوى الميكروجرام/لتر. تتمتع الطريقة بخصوصية جيدة، ولم يتم العثور على شوائب متداخلة، وتلبي بشكل عام متطلبات المعايير.